甲肝:肝癌治療
在肝癌患者，回輸用腫瘤抗原沖擊致敏的樹突狀細胞觀察到了腫瘤的客觀緩解，針對肝癌的動物學試驗已經(jīng)證實，AFP致敏的DC疫苗不僅能夠抑制肝癌細胞的生長，而且對肝細胞的再生沒有影響[28]。GrimmCF等[29]在小鼠肝癌模型應用AFP-DNA疫苗誘導出特異性的CTL，能夠抑制腫瘤的生長，并且對正常肝細胞無損傷。
2）樹突狀細胞 樹突狀細胞（DendriticCell，DC）是體內(nèi)專職抗原提呈細胞，20世紀70年代初Stinman和Cohn首次報道[17]。DC在T細胞免疫應答中發(fā)揮重要作用[18]，除攝取、加工、呈遞特異性抗原外，DC是唯一能刺激初始（Na?ve）T細胞增殖、誘導初次免疫應答的APC，具有啟動特異性免疫應答和誘導免疫耐受的雙重功能。90年代后，DC體外培養(yǎng)獲得成功，使其逐漸成為免疫學和腫瘤生物治療研究熱點。
細胞因子激活的殺傷細胞(Cytokines-inducedkillercells)，為使用多種細胞因子IL-2、IL-4、IFN、TNF和GM-CSF等誘導的具有更強殺傷活性的淋巴細胞。CIK細胞是一類非主要組織相容性復合物和非T細胞受體限制性的免疫活性細胞，其主要效應細胞為CD3+、CD56+T淋巴細胞。由于多種細胞因子之間的協(xié)同作用，使激活的殺傷細胞出現(xiàn)更好的增殖及殺傷活性。CIK細胞可應用于肝癌等多種實體瘤的治療[13-16]。
肝癌治療法一、基因治療 肝癌的發(fā)生和發(fā)展與癌基因的激活和/或抑癌基因的失活有關，因此最理想治療方式為基因治療，主要包：
細胞因子基因治療的發(fā)展趨勢是聯(lián)合基因治療和組織靶向性表達。聯(lián)合基因治療有助于細胞因子間發(fā)揮相互協(xié)同的生物學作用，提高基因治療效果。IL-2和IFN-a的聯(lián)合使用的治療已經(jīng)進入II期臨床，療效確切，副作用不大。
利用肝癌特異性單克隆抗體，將放射性同位素、抗腫瘤藥物、免疫毒素等“彈頭”與其連接，特異性提高肝癌局部的藥物濃度，期望提高治療效果。目前131I-鐵蛋白抗體和131I-抗人肝癌單克隆抗體己用于肝癌臨床治療。有報道：該方法與肝動脈結扎聯(lián)合應用，能明顯縮小肝癌體積，創(chuàng)造手術切除機會，提高和延長肝癌患者生存期。由于McAb具有滲透性差、免疫原性強等缺點，導向作用往往被削弱。隨著分子生物學技術的發(fā)展，現(xiàn)已研制出基因工程抗體，如抗體的人源化改造、單鏈抗體等，可望克服上述缺點。
1、自殺性基因療法： 自殺基因又稱病毒介導的酶前體藥物治療(VDEPT)，是將藥物治療與基因治療技術相結合的一種治療方法。目前用于肝癌基因治療的自殺基因有：單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)基因/GVC系統(tǒng)、胞嘧啶脫氨酶(CD)基因/5-FC系統(tǒng)、嘌呤核昔酸磷酸酶(PNP)基因/氟達拉濱系統(tǒng)等。
細胞，直接造成腫瘤微環(huán)境中細胞因子的高表達，吸引多種免疫細胞大量浸潤并激活其功能，增強對肝癌細胞的免疫應答，有效激活腫瘤特異性免疫反應。由于轉(zhuǎn)導或未轉(zhuǎn)導基因的腫瘤細胞具有相同的腫瘤抗原，其激發(fā)的特異性免疫反應不僅殺傷已導入細胞因子基因的腫瘤細胞，而且對未轉(zhuǎn)導基因的親代腫瘤細胞產(chǎn)生特異性的殺傷，從而治愈腫瘤[6-9]。
研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者DC共刺激分子表達低、IL-12分泌低、刺激T細胞增殖能力弱、壽命短，攝取抗原能力也較正常人DC弱。因此，通過調(diào)節(jié)荷瘤宿主DC功能，從而誘發(fā)或增強宿主抗腫瘤免疫反應，成為腫瘤特異性免疫治療的重要措施。通過修飾改造患者APC，使其攜帶腫瘤特異性抗原活化初始T細胞，產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應的DC疫苗，在動物實驗和臨床試驗中已取到較好的效果[19]。Mule等[20]以黑素瘤細胞溶解物致敏DC免疫患者，產(chǎn)生特異性T細胞應答。黑色素瘤合成肽DC疫苗II期臨床試驗也已在匹斯堡腫瘤研究所完成[21]。治療后，28例患者中2例所有檢測指標均轉(zhuǎn)陰；1例50%的指標下降，并持續(xù)2年。此外，在腎癌[22]、胃腸道腫瘤[23]等的治療中也取得一定療效。進一步隨機臨床試驗報告證實用腫瘤細胞裂解物或射線滅活腫瘤細胞進行治療的腫瘤患者的總生存期和復發(fā)生存期均有所改善[24-227]。
2、免疫調(diào)節(jié)基因 肝癌患者存在免功能低下，因此可通過導入相關免疫調(diào)節(jié)基因，達到提高宿主免疫力和治療作用。使用最為普遍為細胞因子基因治療。目前應用于肝癌基因治療的細胞因子基因有IL-2、IL-12、IFN、TNF和GM-CSF等。根據(jù)轉(zhuǎn)染細胞的不同，細胞因子基因治療可分為2種，一種為將細胞因子基因?qū)朊庖呋钚约毎?，如LAK細胞、樹突狀細胞等，增強其功能，達到提高抗腫瘤免疫的作用。同時LAK等免疫活性細胞具有向腫瘤灶趨化的功能，可使腫瘤灶細胞因子局部濃度提高，更有效地激活腫瘤局部及周圍的抗腫瘤免疫效應。另一種為細胞因子基因?qū)敫伟?/p>
我國為肝癌高發(fā)地區(qū)，發(fā)病具有明顯特征，約90%具有病毒性肝炎背景，肝炎病毒的感染和復制與肝癌的發(fā)生和進展明顯相關。雖然早期亞臨床肝癌手術切除治療效果較好，但是多數(shù)患者就診時腫瘤已進展至晚期，有效治療方法不多。肝癌患者中約80%可見AFP陽性，50%患者肝癌組織中P53高表達，60%患者可檢測到病毒性肝炎抗原，為肝癌的生物治療提供了良好的靶向。目前肝癌生物治療主要集中在基因治療，免疫治療。
CD基因編碼胞嘧啶脫氨酶可將進入肝癌細胞中的5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)化為5-FU殺死肝癌細胞。Gaveui等[2]經(jīng)肝被膜下和門靜脈注射，用CD基因轉(zhuǎn)染和5-FC治療鼠肝癌模型，96％的實驗動物肝癌體積縮小。CD基因還可通過誘導及增強宿主的免疫系統(tǒng)功能，活化淋巴細胞，促進CD4+和CD8+T淋巴細胞在腫瘤局部浸潤，提高機體對肝癌免疫監(jiān)視和免疫清除功能，抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展。Krohne等[3]用PNP/氟達拉濱系統(tǒng)轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2和Hep3B，結果HepG2和Hep3B肝癌細胞株死亡。
單純疤疹病毒(HSV)載體攜帶胸腺嘧啶激酶基因(TK)，進入肝臟腫瘤細胞并表達HSV-TK基因，使丙氧鳥苷三磷酸化，抑制肝癌細胞DNA聚合酶活性，或代替dTP摻入到細胞DNA中，使肝癌細胞蛋白質(zhì)合成受到抑制，肝癌細胞死亡。此外HSV-TK-GCV系統(tǒng)還可通過旁觀者效應殺傷肝癌細胞，不僅轉(zhuǎn)染了HSV-TK基因的肝癌細胞大量死亡，而且周圍未經(jīng)轉(zhuǎn)染的肝癌細胞亦有明顯的死亡。HSV-TK-GCV系統(tǒng)還可通過誘導機體免疫反應，使肝癌組織周圍CD4+和CD8+T淋巴細胞大量浸潤，抑制肝癌細胞增殖。目前實驗研究表明HSV-TK-GCV系統(tǒng)抗肝癌作用確切，已進入臨床I期試驗[1]。
我們根據(jù)原發(fā)性HBV感染的肝癌表達病毒抗原HBsAg的特點，以HBsAg作為靶點，采用HBsAg基因脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染的未成熟單個核細胞來源的樹突狀細胞，能夠誘導特異性的CTL，能夠表達乙型肝炎表面抗原。CTL對表達HBsAg的肝癌細胞HepG2.2.15有較強的殺傷作用，MTT法檢測顯示細胞毒性作用明顯增強（P<0.01)。對于原發(fā)性HBV感染肝癌的免疫治療，DC疫苗有望成為表達HBsAg肝癌的一種免疫治療手段?！ ∧[瘤免疫治療的關鍵是如何找到腫瘤特異的排斥抗原，近年來外來體（exosome）作為一種嶄新的腫瘤抗原的來源，逐漸成為非細胞性腫瘤疫苗研究的熱點。有學者證明腫瘤細胞本身也可以產(chǎn)生外來體，當將這些外來體負載到人樹突狀細胞的時候，可以誘導出T細胞免疫應答。而且來源于腫瘤細胞的外來體含有共有腫瘤排斥抗原（sharedtumorrejectedantigen）[30]，極大地擴展了外來體作為腫瘤疫苗的可能性。
肝癌治療法二、免疫治療 1、單克隆抗體和細胞因子 八十年代，伴隨著分子生物學技術的發(fā)展，許多細胞因子的基因被克隆，并且運用基因重組技術在原核或真核細胞中進行表達，使那些在生理條件下難以分離的細胞因子和抗體得以大量生產(chǎn)，特異性免疫治療。臨床上—般多用于肝癌綜合治療，可單獨或與免疫活性細胞以及肝癌疫苗聯(lián)合使用。
腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL），為采集腫瘤組織間浸潤淋巴細胞，體外培養(yǎng)擴增而成。Schonoclonf等[10]作TIL的細胞表型分析，提示大多為成熟的CD3+細胞，其百分比在80％以上，TIL的NK細胞比率均較低，為5％左右，而LAK細胞中的NK細胞比例為10％左右，說明LAK細胞與TIL細胞在抗腫瘤作用中有不同的殺傷機制參與結果。TIL的殺傷效率高于LAK，wallace[11]在體內(nèi)示蹤TIL與LAK細胞時發(fā)現(xiàn)，只有當腫瘤部位的活性細胞數(shù)達到一定數(shù)量后才能顯示其治療效果，TIL回輸后主要積聚在肝臟，提示了TIL在肝癌治療中的進一步應用的有利因素[12]。
2、細胞免疫治療： 1）LAK細胞、TIL細胞和CIK細胞 淋巴細胞因子激活的殺傷細胞（LAK），為IL-2在體外活化和擴增的淋巴細胞對腫瘤細胞有較強的殺傷活性，殺傷瘤譜較廣，而且不損傷正常的淋巴細胞，稱為淋巴因子激活的殺傷細胞。經(jīng)IL-2激活后的效應LAK細胞在體內(nèi)外對多種腫瘤細胞具有很強的溶解放應，通過對LAK細胞活性的觀察，可以推測機體腫瘤免疫的狀態(tài)，同時對指導臨床免疫有重要意義[]。臨床研究中應用體外活化和擴增的LAK輸入病人體內(nèi)的過繼免疫治療，對黑色素瘤、腎細胞癌、淋巴瘤等有一定療效。
肝癌的生物治療 腫瘤生物治療技術問世以來，得到迅速發(fā)展，已成為有別于傳統(tǒng)治療方式的一種極具希望的抗腫瘤治療手段。
近年來在自殺基因系統(tǒng)的基礎上，提倡合并使用其他抗肝癌生物治療方法，如聯(lián)合使用細胞因子，可促進CTL細胞及NK細胞增殖，細胞毒作用增加。Kim等[4]聯(lián)合應用CD/5-FC和IL-18轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株，結果肝癌周圍可見大量CD4+和CD8+T淋巴細胞浸潤，肝腫瘤體積明顯縮小，明顯優(yōu)于單用CD/5-FC組或IL-18組。Kwang等[5]將IL-2與HSV-TK基因聯(lián)合應用于活體治療肺癌肝轉(zhuǎn)移，結果肝腫瘤完全消退。
我們應用肝癌細胞HepG2凍融抗原致敏DC（Hep-DC），與自體淋巴細胞共培養(yǎng)后，進行體外殺傷試驗。結果顯示Hep-DC-L對HepG2具有較強的殺傷作用，明顯高于未致敏DC刺激的淋巴細胞（DC-L）和單純淋巴細胞（L）（P<0.05），提示HepG2凍融抗原致敏的DC可誘導自體淋巴細胞產(chǎn)生HepG2抗原特異性CTL，對HepG2發(fā)揮高效特異的殺傷作用。 在此基礎上，我們應用AFP-cDNA真核表達載體轉(zhuǎn)染DC制備AFP-DC瘤苗，電化學發(fā)光法檢測培養(yǎng)上清中含有AFP抗原分子，證實AFP-DC能夠表達并分泌AFP，同時，細胞免疫熒光染色可見細胞膜及胞漿熒光染色陽性，表明AFP-DC不僅能夠表達AFP，并且能夠?qū)FP抗原分子提呈到細胞膜上。AFP-DC活化的CTL對表達AFP的肝癌細胞株HepG2有強的殺傷作用，與對照組相比，差異顯著，表明AFP-DC活化的CTL是AFP特異性的。證實肝癌相關性抗原AFP可作為肝癌靶向治療的突破點，AFP-DC疫苗可以成功誘導出AFP特異性CTL，對表達AFP的肝癌細胞株HepG2具有特異性殺傷效用。
我們以健康供者外周血單個核細胞（PBSC）為來源，在GM-CSF、TNF-a和IL-4作用下體外誘導培養(yǎng)出具有典型形態(tài)特征和表型的DC，誘導的DC光鏡和掃描電鏡下細胞周圍可見毛刺狀突起和樹枝狀突起，透射電鏡下細胞表面不規(guī)則，可見各級突起，胞內(nèi)可見溶酶體、線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達；DC特征性表型CD1a、CD11c表達量分別為47.7%、78.49%，MHC分子HLA-DR和共刺激分子CD80、CD86表達量分別為66.09%、51.37%、55.83%。
我們采用基因重組技術構建了用乙肝病毒表面抗原“a”位點基因替換CD74分子的CLIP片段基因的真核表達質(zhì)粒，希望通過恒定鏈分子的引導肽將該抗原引導到MVB中，從而進入外來體的形成通路，最終將目的抗原負載到外來體。同時我們利用外來體的直徑是50~90nm的物理特性，采用用基于孔徑的生物膜分離技術成功地制備了外來體。希望能采用外來體提取肝癌等腫瘤抗原，解決肝癌生物治療中特異性腫瘤抗原來源困難的問題 生物肝癌治療法日新月異，隨著現(xiàn)代基礎醫(yī)學的不斷進步，新的治療方法和手段層出不窮，我們相信其治療效果將會得到極大改善，在臨床應用中挽救更多的生命。
