中華醫(yī)學(xué)會(huì)北京分會(huì)檢驗(yàn)專業(yè)委員會(huì)在北京舉行了全國(guó)臨床檢驗(yàn)學(xué)術(shù)研討會(huì),下面選登部分論文。
丙型肝炎實(shí)驗(yàn)室技術(shù)研究進(jìn)展
北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院肝病研究所陶其敏
病毒性肝炎，以其流行的全球性和對(duì)健康危害的嚴(yán)重性吸引著人們的廣泛關(guān)注。以侵犯人類肝臟為靶器官的肝炎病毒，現(xiàn)在至少有7種，即甲型肝炎病毒(HAV)(屬于小RNA病毒科)、乙型肝炎病毒(HBV)(屬于噬肝DNA病毒科)、丙型肝炎病毒(HCV)(屬于黃病毒科)、丁型肝炎病毒(HDV)(屬于缺陷型病毒)、戊型肝炎病毒(HEV)(屬于杯狀病毒科)、已性肝炎病毒(HFV)(尚未確切)、庚型肝炎病毒(HGV)(屬于黃病毒科)。7種病毒的核酸類型、形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗原組成、致病性、免疫性和傳播途徑各不相同，此外，還有巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒等在經(jīng)過肝臟時(shí)偶爾亦可引起肝炎。
第一節(jié)從非甲非乙型肝炎到丙型肝炎
1968-1974年間，HAV、HBV感染特異性診斷方法相繼建立，為臨床診斷和篩選獻(xiàn)血者提供了可靠的手段。但人們很快就發(fā)現(xiàn)除了HAV、HBV及CMV、EBV外，還有一種引起輸血后肝炎的至病因子。1974年紐約血液中心的Pince及其同事對(duì)204例接受心血管手術(shù)的病人進(jìn)行隨訪，6個(gè)月時(shí)有51人(25%)發(fā)生了輸血后肝炎，其中有12人與HBV感染有關(guān)。CMV顯然不是輸血后肝炎的原因，因?yàn)榍罢咂骄鶟摲谔L(zhǎng)，幾乎與乙型肝炎相等。于是他們提出，對(duì)輸血后肝炎的控制，需首先弄清另一種肝炎病毒。
1989年9月在東京召開的國(guó)際非甲非乙型肝炎會(huì)議上正式命名此種病毒為丙型肝炎病毒(HCV)，由HCV引起的肝炎稱之為丙型肝炎(HC)。
第二節(jié)HCV基因和功能
HCV是一種新的病毒類型，其基因組編碼多肽與其他病毒序列之間整體同源性較小，然而幾組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HCV是人類黃病毒(如黃熱病毒、登革熱病毒和日本腦炎病毒)和動(dòng)物瘟病毒(牛腹瀉病毒和豬霍亂病毒)的遠(yuǎn)親。首先HCV5，末端區(qū)域與瘟病毒的對(duì)應(yīng)區(qū)域有較多的同源性(45%到49%)，而HCV多肽的親水性同黃病毒多蛋白是很相符的，還有三者的基因結(jié)構(gòu)和功能也是相似的。這與近來把它們分類為黃病毒中3個(gè)不同的屬相一致。
HCV與瘟病毒、黃病毒的親緣進(jìn)化關(guān)系，可能促進(jìn)將來有關(guān)HCV感染的生物學(xué)研究，亦可能有助于一些重要問題的解決，如：HCV非輸血傳播途徑中可能涉及的媒介、某種細(xì)胞作為病毒儲(chǔ)存庫(kù)的可能性、是否存在病毒基因在宿主基因的整合導(dǎo)致慢性化、是否存在通常的嗜肝外的不同細(xì)胞的新嗜性引起臨床表現(xiàn)的多樣化、以及是否存有抗體依賴性加強(qiáng)現(xiàn)象等。此外，黃病毒減毒活疫苗的成功，為HCV重組疫苗的開發(fā)提供了樂觀前景。
第三節(jié)HCV株型和中國(guó)北方HCV株序列分析
自從1989年Choo報(bào)道HCV部分序列(7310bp)以來，許多研究者已完成了多個(gè)HCV全基因或基因片段分析。從已有的數(shù)據(jù)看，這些不同克隆的核苷酸(nt)有很大差異，同源性從57%到92%不等。不同型克隆間1.5)的血清進(jìn)行了全基因序列分析。HCJ1為I型(美歐主要類型)，HCJ4為II型(日本主要類型)。J6、J7分屬于III型和IV型。分析結(jié)果：北京25例為II型，哈密8例II型，4例III型，4例II+III。因此，中國(guó)HCV基因型以II型為主，和日本的主要類型一致。雖然我所建立的三組克隆，可能同屬一個(gè)株型，但這并不意味著中國(guó)只有1個(gè)株型存在。隨著中國(guó)不同地區(qū)大量的HCV被克隆，可能還會(huì)發(fā)現(xiàn)其它株型，不過可以推論，HCVCHN1可能是中國(guó)的主要株型。
第四節(jié)HCV感染的實(shí)驗(yàn)診斷
目前用于HCV感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法主要有兩種，檢測(cè)抗-HCV和HCVRNA。
一、抗-HCV檢測(cè)
1989年5月，美國(guó)Chiron公司用分子克隆法分離到一個(gè)能表達(dá)NANB肝炎病毒特異性蛋白的cDNA克隆5-1-1。又將3個(gè)與5-1-1有共同ORF的重疊克隆連接起來建立了另一個(gè)克隆C100。C100與超氧化物歧化酶(SOD)基因融合在酵母中重組表達(dá)的多肽即C100-3。完整的C100-3多肽的N端有154個(gè)SOD氨基酸，5個(gè)由EcoRⅠ位點(diǎn)人工接頭表達(dá)的氨基酸和363個(gè)HCVC100cDNA編碼的氨基酸；在其C端還有5個(gè)MS2的氨基酸。
HCVC100-3抗體檢測(cè)系統(tǒng)，是最早應(yīng)用的檢測(cè)方法。世界各地關(guān)于HCV在各種人群中的感染率，基本上都是來自這種試劑盒的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果證明，HCV是世界上幾乎所有輸血后非甲非乙型肝炎和部分散發(fā)性非甲非乙型肝炎的病因病毒。由于C100只含363個(gè)氨基酸，而HCV基因組編碼的蛋白有長(zhǎng)達(dá)3010個(gè)氨基酸。因此C100-3抗原-抗體系統(tǒng)只代表整個(gè)HCV抗原抗體系統(tǒng)的一小部分，所以敏感性不高，抗C100-3出現(xiàn)也太晚，不適于早期診斷，有些病人根本不出現(xiàn)。而PCR方法卻可檢出HCVRNA，但有一定的漏檢率。該方法使用的抗原含SOD融合蛋白，因此，當(dāng)人體存有抗-SOD時(shí)常常出現(xiàn)假陽性。
隨著HCV基因序列的闡明，人們發(fā)現(xiàn)C區(qū)基因編碼蛋白較E區(qū)和某些非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白都保守，因此，用C區(qū)基因產(chǎn)物檢測(cè)HCV抗體顯得更加合理，于是相繼建立了一些新的檢測(cè)方法，試圖克服C100抗原的某些缺陷，稱之為第二代抗-HCV試劑。
第二代重組基因多肽檢測(cè)抗-HCV的ELISA技術(shù)是在原包被抗原加入了核心抗原C22-3、C120、C11。和第一代試劑(C100-3)相比，第二代試劑具有檢出率高(可提高25-30%)，而且抗體出現(xiàn)提早到16-60天。由于重組基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以仍存在抗-SOD造成的假陽性，問題于是激發(fā)人們建立人工合成肽段檢測(cè)抗-HCV的新試劑。
我所用中國(guó)北方地區(qū)HCV全基因序列，根據(jù)文獻(xiàn)開發(fā)的預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原決定簇可能位點(diǎn)的序列軟件，完成了HCV全基因序列的親水性、親近性、移動(dòng)性分析，已預(yù)測(cè)到HCV抗原決定簇的位點(diǎn)。先對(duì)研制的C區(qū)3個(gè)寡肽(CPA、CP36、CP20)進(jìn)行了抗原活性比較并初步應(yīng)用于臨床，同時(shí)與日本基因工程C區(qū)表達(dá)多肽C11進(jìn)行比較。CP8+CP36陽性率與C11的陽性率無明顯差異，符合率為87.6%。用本所建立的雙PCR試驗(yàn)，比較82例抗-CP與HCVRNA的檢測(cè)結(jié)果，符合率為87.5%。
二、HCVRNA的檢測(cè)：
聚合酶鏈反應(yīng)是目前分子生物學(xué)中最敏感的方法，樣品中只要有一個(gè)拷貝的HCV序列就有可能被檢出。由于HCV在被感染者體內(nèi)濃度很低，不能用一般的免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)病人血清中的抗原，目前只能用逆轉(zhuǎn)錄DNAPCR(RT-PCR)才能檢測(cè)到血清中的HCVRNA。PCR技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)：1、特異性強(qiáng)抗-HCV陽性不能直接說明受檢者體內(nèi)當(dāng)時(shí)HCV是否存在，而PCR所檢的HCVRNA可作為有無傳染性的直接指標(biāo)。2、敏感性高可發(fā)現(xiàn)抗-HCV陰性者HCV感染。3、陽性出現(xiàn)早可在ALT增高的同時(shí)檢出。黑猩猩感染HCV后第三天即可在血清中檢出HCVRNA。4、應(yīng)用較廣泛可檢測(cè)組織和體液中RNA。但操作程序較復(fù)雜，技術(shù)要求嚴(yán)格，試驗(yàn)成本高，所以只限于有條件的實(shí)驗(yàn)室使用。1991年我所建立了一項(xiàng)直接檢測(cè)HCVPCR的雙重PCR法，亦可稱“一步法”。特點(diǎn)是微量(可從100μL血清中提到RNA)、簡(jiǎn)便(不用低溫超速離心機(jī)等設(shè)備)、快速(從提取RNA逆轉(zhuǎn)錄可在4小時(shí)完成)、減少Rnase污染，1-2天內(nèi)可發(fā)報(bào)告。由于PCR的諸多優(yōu)點(diǎn)，只要不斷的改進(jìn)方法，使之更趨簡(jiǎn)便、快速，必將成為HCV感染診斷的重要手段。
我所最近的研究結(jié)果表明，在原RT-PCT的基礎(chǔ)上再進(jìn)行定量PCR，其方法是在樣品PCR反應(yīng)混合液內(nèi)加入3HdTTP摻入，液閃法測(cè)定3H摻入的CPM值以純化已知濃度的cDNAsfuw(10pg/每管30Ul)，再計(jì)算待測(cè)血清中RNA的動(dòng)態(tài)變化。初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在治療前后血清中RNA的深度變化較大。2例病人用α-干擾素治療的病人中，雖然血清ALT轉(zhuǎn)為正常，但血清中的RNA含量變化不大。提示該方法對(duì)丙型肝炎的療效觀察有一定的參考價(jià)值。
現(xiàn)在市售的抗-HCV試劑盒，分別由重組基因多肽人工合成多肽組成，基因工程多肽的優(yōu)點(diǎn)是：1、可包含多個(gè)抗原位點(diǎn)。2、一旦克隆表達(dá)成功則產(chǎn)量高、價(jià)格低。3、表達(dá)多肽的穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)是：1、克隆表達(dá)技術(shù)要求較高，不易達(dá)到滿意結(jié)果。2、表達(dá)產(chǎn)物純化困難，含有菌體等其它蛋白干擾。3、每批產(chǎn)量間穩(wěn)定性比間差異小。3、可將幾個(gè)片段重合使用，有較高的特異性和敏感性。4、純化簡(jiǎn)單，無其它蛋白干擾。5、可做抑制試驗(yàn)。我們合成的EP27及其檢測(cè)結(jié)果，提示了它與第二代抗-HCV試劑的不同點(diǎn)。不過這項(xiàng)研究剛剛開始，所得結(jié)果僅是初步的。對(duì)E區(qū)試劑的開發(fā)只是一個(gè)嘗試或者說剛剛敲開了E區(qū)基因的大門，研究尚待深入。（責(zé)任編輯：楊華）
