甲肝:免疫損傷
1.5.2 PT測(cè)定，自動(dòng)凝血儀(比濁法)，直接報(bào)告PT(±s)，同時(shí)加做正常對(duì)照。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及肝纖維化模型制作 健康Wister大鼠40只，5月齡，雌雄各半，體重214. 7±25g，北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供。飼養(yǎng)觀察1周后用于實(shí)驗(yàn)。按性別進(jìn)行區(qū)組設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組（實(shí)驗(yàn)對(duì)照組）、高劑量治療組、低劑量治療組，每組10只（雌雄各半）。除正常對(duì)照組外，每周給其他3組大鼠腹腔注射豬血清2次，每次0. 5ml/只，連續(xù)8周。制成肝纖維化模型。
模型組肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，小葉內(nèi)和小葉間、匯管區(qū)等間質(zhì)細(xì)胞成分和纖維成分明顯增高，肝細(xì)胞核變形或稍固縮，細(xì)胞邊界不清楚，胞質(zhì)不均勻或大空泡（圖2）。Mallory染色時(shí)，可見(jiàn)大量藍(lán)綠色粗大的膠原纖維束，呈放射狀插入肝小葉，將肝臟分割成以匯管區(qū)為中心的假小葉。經(jīng)彩色圖象分析儀統(tǒng)計(jì)，可見(jiàn)肝內(nèi)膠原纖維面密度明顯高與其他組（表3）。治療后大劑量組肝細(xì)胞內(nèi)空泡減少，纖維成分減少；而小劑量組纖維成分較少不明顯（圖3、4）。
3 討論
2.2 肝功能改變
1.1.2 自動(dòng)血凝儀及相關(guān)試劑，用于PT測(cè)定。
3.1 豬血清誘發(fā)大鼠免疫損傷性肝纖維化的機(jī)理，主要是血清引起機(jī)體產(chǎn)生可溶性免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體。由于肝細(xì)胞表面存在Fc受體，可與免疫復(fù)合物結(jié)合而沉積于細(xì)胞膜，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷并激發(fā)肝細(xì)胞、貯脂細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增生，表現(xiàn)為Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)。本模型與臨床乙型肝炎病毒引起的慢性活動(dòng)性肝炎和肝硬化與自身免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有相似性，故對(duì)指導(dǎo)臨床研究有很重要價(jià)值。
1.6 形態(tài)學(xué)檢查 快速處死動(dòng)物，肝臟多部位取材，液體石蠟包埋，制備冰凍切片，分別進(jìn)行HE、Mallory和免疫組化染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝小葉結(jié)構(gòu)和膠原纖維密度，用網(wǎng)格計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)吞噬細(xì)胞和儲(chǔ)脂細(xì)胞密度。
2.3 形態(tài)學(xué)觀察(HE和Mallory染色) 正常組大鼠肝臟中以肝細(xì)胞為主，結(jié)締組織和間質(zhì)細(xì)胞較少，因此肝小葉分界不明顯，肝小葉間匯管區(qū)可見(jiàn)小葉間A、V和膽管，其中結(jié)締組織和纖維成分較少；膠原纖維成分也很少。肝細(xì)胞為多邊形，邊界可見(jiàn)，胞質(zhì)弱嗜酸性，均勻一致，胞核呈圓形，1～2個(gè)，嗜堿性（圖1）。
2.2.2 治療前后大鼠凝血酶原時(shí)間的變化（表2），各組均與模型組（實(shí)驗(yàn)對(duì)照組）比較。表2 各組大鼠凝血酶原時(shí)間（PT）測(cè)定結(jié)果注：各組均與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較表2顯示：血漿凝血酶原時(shí)間（PT），實(shí)驗(yàn)對(duì)照組較治療組明顯延長(zhǎng)，差異極為顯著（P<0. 0005）。
3.3 祖國(guó)醫(yī)學(xué)著作（失血大法）闡述：“失血一癥，大抵由于肝不藏血，脾不統(tǒng)血”；繆仲醇《先醒齋醫(yī)學(xué)廣筆記·吐血篇》云“吐血者，肝失其職也”；近代周炳麟認(rèn)為：“血癥之患，肝臟首當(dāng)其沖”，可見(jiàn)肝、脾與血癥的密切關(guān)系。肝藏血功能指肝有貯存血液、調(diào)節(jié)血量和化生血液的作用。血漿蛋白不僅是構(gòu)成血液的主要成分，并且對(duì)維持滲透壓、保持凝血-抗凝和纖溶的動(dòng)態(tài)平衡起著重要的作用。肝不藏血之說(shuō)雖不能等同于肝病出血，但包括在其范圍之內(nèi)，各種致病因素?fù)p及肝臟，將會(huì)使肝藏血、化生血液成分的功能受到影響，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)合成減少和凝血、抗凝及纖溶障礙。從而導(dǎo)致出血或血栓形成。
2.1 一般狀況觀察 肝損傷大鼠在實(shí)驗(yàn)初期毛發(fā)光亮、一般狀態(tài)良好。與正常對(duì)照組大鼠相比，飲食、飲水無(wú)異常變化，4～7周后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組體重增長(zhǎng)緩慢，8～11周治療期間體重增長(zhǎng)較快，且大劑量組明顯優(yōu)于小劑量組。
圖6 陽(yáng)性貯脂細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色S-MA免疫組化染色400×
凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ是由肝細(xì)胞合成的維生素K依賴(lài)性凝血因子。肝纖維化（硬化）時(shí)，在肝損傷尚未引起循環(huán)衰竭的情況下，大鼠PT延長(zhǎng)，臨床表現(xiàn)為出血傾向。由于：①肝細(xì)胞損害時(shí)，蛋白質(zhì)合成功能低下，維生素K吸收障礙，使維生素K依賴(lài)性凝血因子的前體不能轉(zhuǎn)化為有活性的凝血因子。導(dǎo)致凝血障礙。②肝病變時(shí)，由于肝細(xì)胞功能紊亂，合成肝素酶的功能降低，使肝臟對(duì)肝素或肝素類(lèi)物質(zhì)的滅活能力下降，血漿中肝素濃度增加，抗凝活性增強(qiáng)。③肝功能障礙引起凝血因子合成減少，最先影響FⅦ，其次是FⅡ，最后是FⅤ和FⅩ。相對(duì)于內(nèi)源性凝血途徑和其他因子而言，F(xiàn)Ⅶ的生物半壽期最短（6～8h），因此在反映肝源性凝血障礙和功能恢復(fù)的檢測(cè)指標(biāo)中，PT較為敏感。本研究高劑量治療組PT較正常對(duì)照組略低，但該差異無(wú)臨床意義（<3s）。
1.3 中藥組方：黃芪、蜈蚣、三七、山慈姑、郁金、枳實(shí)、白術(shù)。采用現(xiàn)代中藥制劑工藝，通過(guò)質(zhì)量監(jiān)測(cè)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、衛(wèi)生學(xué)檢查等環(huán)節(jié)制成標(biāo)準(zhǔn)顆粒劑備用。臨時(shí)按劑量要求配成水溶液即可服用。
1.4 肝纖維化大鼠的藥物治療 分別給低劑量、高劑量治療組以制備好的中藥顆粒溶液灌胃，劑量分別為1g/1ml/100g體重、2g/1ml/100g體重；1次/d，共4周。
本研究在給模型組采血時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使采血很順利，血液和抗凝劑及時(shí)徹底的混合，仍有2只大鼠采血后立即發(fā)生了凝血，可見(jiàn)少部分肝纖維化的大鼠已處于高凝狀態(tài)。血漿凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)固然與FⅦ合成不足有關(guān)，但也不排除由于凝血因子的提前過(guò)度消耗而引起繼發(fā)性凝血障礙。
1.1.1 日立7150自動(dòng)生化分析儀及相關(guān)試劑，測(cè)定血清ALT及A、G（A/G）。
吞噬細(xì)胞和儲(chǔ)脂細(xì)胞模型組顯著高于正常對(duì)照組（表4），治療后略有降低，高劑量組較低劑量組降低明顯（圖5、6）。表3 肝間質(zhì)膠原纖維密度（Mallory染色）（面密度/μm2，x±s）注：*與正常組比較有顯著性差異P<0. 05;Δ與模型組比較有顯著性差異P<0. 05 表4 儲(chǔ)脂細(xì)胞和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)/視野）（免疫組化染色）（±s)
3.4 中藥復(fù)方針對(duì)肝纖維化的病機(jī)特點(diǎn)（本虛標(biāo)實(shí)），據(jù)治肝補(bǔ)脾原則組方，達(dá)益氣健脾、理血軟肝之功效。其作用機(jī)理為：①有效地保護(hù)肝細(xì)胞，減輕肝細(xì)胞變性壞死的程度。如：黃芪、白術(shù)可保護(hù)肝細(xì)胞，促進(jìn)肝糖原合成；郁金（姜黃素）對(duì)肝細(xì)胞損害有抑制作用；山慈姑（秋水仙堿）有促進(jìn)肝細(xì)胞再生，減少肝小葉變性壞死的作用。②有效地調(diào)節(jié)免疫功能。其中黃芪（黃芪多糖）、白術(shù)能增強(qiáng)機(jī)體免疫活性，對(duì)細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異免疫均有調(diào)理作用。③有促凝和抗凝活性，控制出血、凝血傾向。三七有明顯的護(hù)肝作用，使肝細(xì)胞合成凝血因子和滅活肝素類(lèi)物質(zhì)的能力不至嚴(yán)重減低，糾正凝血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間；白術(shù)有抗凝血作用，枳實(shí)可增加冠脈流量，減少血管阻力，改善肝臟微循環(huán)。④抑制膠原纖維增生，預(yù)防和延緩肝硬變的發(fā)生。山慈姑的主要成分為秋水仙堿，能抑制肝內(nèi)儲(chǔ)脂細(xì)胞(結(jié)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞)的增殖和轉(zhuǎn)化，減少膠原合成及在肝竇周沉積［6］，從而減輕肝脾腫大，延緩肝硬變的發(fā)生。蜈蚣能解毒軟堅(jiān)，組織切片觀察結(jié)果也證實(shí)了這一作用。因此，中藥復(fù)方在保護(hù)肝臟（恢復(fù)肝功能）、改善肝臟微循環(huán)、抗肝纖維化和改善出血傾向等方面起到明顯療效，是臨床有待開(kāi)發(fā)應(yīng)用的良方。
2 結(jié)果
1.5 給各組動(dòng)物心臟采血，制備血清及枸櫞酸鈉（1:9）抗凝血漿用于以下測(cè)定。
1.1 儀器或試劑
1.5.1 ALT、A、G測(cè)定，自動(dòng)生化分析儀預(yù)熱30min后,常規(guī)測(cè)定血清蛋白濃度g/L（±s），計(jì)算A/G。
肝纖維化在不同進(jìn)展時(shí)期引起相應(yīng)的形態(tài)及功能改變。中醫(yī)藥治療免疫損傷性肝纖維化有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)驗(yàn)研究及臨床報(bào)道中，不同醫(yī)家所報(bào)道的組方形式及觀察指標(biāo)各有側(cè)重。本文就肝纖維化大鼠模型治療前后肝細(xì)胞功能及肝小葉組織的形態(tài)學(xué)變化對(duì)芪蚣抗纖方的療效進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。
1 材料與方法
3.2 反映肝細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)為轉(zhuǎn)氨酶，肝損傷急性期，轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，疾病發(fā)展到慢性期則維持在略高的水平。此時(shí)蛋白質(zhì)的變化更為明顯。血漿中的白蛋白主要在肝細(xì)胞內(nèi)合成，肝纖維化（硬化）時(shí)，正常肝細(xì)胞數(shù)目減少，單核巨噬細(xì)胞增生，表現(xiàn)為血漿白蛋白降低，球蛋升高，A/G下降甚至倒置。經(jīng)有效治療后，隨著肝細(xì)胞的再生，蛋白質(zhì)合成功能得到恢復(fù)。
2.2.1 治療前后各組ALT、A、G及A/G測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)表1）。表1 血清ALT、A/G變化情況表1顯示：與正常對(duì)照組比較，模型組ALT顯著升高（P<0. 001）,A/G比值顯著低于正常組（P<0. 05）。而高低劑量治療組ALT均低于模型組（0. 01
中藥復(fù)方對(duì)免疫損傷性肝纖維化大鼠肝損害的療效觀察
